
Содержание материала
• Биохимические особенности брожения виноградного сусла в потоке
• Методика исследований
• Изменения количества общего азота в виноматериалах
• Изменение содержания высших спиртов
• Изменение содержания этилацетата и энантовых эфиров
• Обсуждение результатов
Приготовление виноградного вина связано с жизнедеятельностью дрожжей, их развитием и обменом веществ. В результате биохимической деятельности дрожжей при сбраживании сахаров виноградного сусла наряду с главным продуктом брожения — этанолом всегда образуются побочные и вторичные продукты, обусловливающие вкус и букет вина.
В процессе жизнедеятельности дрожжей в зависимости от условий брожения виноградного сусла, а также от технологических приемов изготовления вин могут накапливаться самые разнообразные продукты. Знание закономерностей образования вторичных и побочных продуктов при брожении виноградного сусла позволило бы контролировать уровень образования и степень влияния их на качество вин.
С. А. Коновалов считает одним из наиболее эффективных средств управления обменом веществ микроорганизмов метод непрерывного культивирования [5]. На протяжении сорока с лишним лет после создания С. В. Лебедевым теории и практического обоснования непрерывного процесса брожения ведутся исследования по размножению бактерий, бацилл и дрожжей непрерывным методом, которые и легли в основу создания производственных поточных процессов.
В технологическом процессе приготовления виноградных вин господствующее положение занимает так называемый периодический, пли стационарный, способ брожения. Однако в последние годы все больше внимания уделяется поточному процессу брожения. В виноделии используются многоступенчато-батарейные аппараты непрерывного брожения. По направлению потока сбраживаемое сусло изменяет химический состав, постепенно превращаясь в виноматериал, физиологическое состояние дрожжей также изменяется и к концу выбраживания они стареют и отмирают. По определению Н. Д. Иерусалимского, такой метод является непрерывным только с технологической точки зрения, но не с физиологической [2]. В основной своей массе клетки дрожжей перемещаются через всю бродильную батарею, совсем не находясь в постоянно установившихся условиях, хотя частичное распределение дрожжей по фракциям в отдельных резервуарах батареи существует.
Основное преимущество поточного брожения состоит в возможности управлять обменом веществ дрожжей. Поточное брожение отличается от периодического непрерывным поступлением свежего сусла и связанным с этим постоянным обновлением дрожжей. Такое состояние их не может не сказаться на работе ферментных систем, а следовательно и на накоплении продуктов обмена. При непрерывном брожении можно поддерживать дрожжи в различном физиологическом состоянии и получать продукты обмена, необходимые для повышения качества вина.
Таким образом, в условиях непрерывного брожения возможно в более широких пределах регулировать химический состав бродящей среды, т. е. влиять на качество виноматериала. Кроме температурного фактора и спиртования, использующихся и при периодическом брожении в качестве регуляторов состава вин, поточное брожение позволяет воздействовать на содержание азотистых веществ в виноматериале, уменьшая или увеличивая их количестве, содержащееся в сусле [9].
Для осуществления непрерывного брожения в виноделии разработана новая технология и специальная аппаратура. Предложены поточные бродильные установки разных конструкций: «Молдавская», состоящая из системы вертикальных резервуаров с перетоком бродящей жидкости снизу вверх; «Грузинская», аналогичная «Молдавской», но с перетоком сверху вниз; «Московская», представляющая собой вертикальную башню, в нижнюю часть которой подается сусло, а из верхней части вытекает виноматериал; «Украинская», состоящая из системы горизонтальных цистерн, соединенных последовательно [3]. Все эти установки испытывались в течение нескольких сезонов виноделия и рекомендованы для ведения поточного брожения виноградного сусла в производстве.
Следовательно, вопросы аппаратурно-технического оформления поточных процессов выбраживания сусла в настоящее время нашли свое рациональное решение, и непрерывный метод брожения внедрен на ряде винодельческих заводов.
Что касается особенностей обмена веществ винных дрожжей и биохимии поточного брожения виноградного сусла, то эти вопросы еще далеко недостаточно изучены.
В связи с применением поточного брожения в виноделии считаем необходимым обратить внимание на следующие вопросы:
в спиртовой промышленности главной задачей проведения брожения является максимальный выход этанола в наиболее короткое время, т. с. выход и производительность. Это легко понять, так как этанол в конце концов подвергается тщательной очистке от примесей. В виноделии конечным продуктом является не этанол, а бражка со всеми находящимися в ней примесями, влияющими на качество вина. Поэтому винодел должен знать закономерности образования и накопления примесей и научиться управлять их биосинтезом;
к примесям, кроме этанола — основного продукта обмена, необходимо отнести следующие продукты обмена дрожжей: высшие спирты (изоамиловый, изобутиловый, -пропиловый и др.), сложные эфиры (этилацетат, энантовые эфиры и др.), кислоты (уксусная, пировиноградная, янтарная, лимонная, молочная и др.), глицерин, уксусный альдегид, ацетоин, диацетил, 2,3-бутиленгликоль, азотистые вещества (аминокислоты, пептиды, витамины, ферменты) и другие, выделяемые живыми дрожжами в ходе их жизнедеятельности или мертвыми в результате автолиза.
Задачей будущих исследований является более подробное изучение и идентификация всех веществ, возникающих в ходе спиртового брожения в зависимости от тех или иных условий.
В настоящее время к основным примесям, несомненно влияющим на качество вин, относят следующие.
Высшие спирты — сивушные масла. Являются отрицательным фактором вследствие токсичности для человеческого организма и неприятного оттенка во вкусе и букете, поэтому количество высших спиртов в винах должно быть минимальным. Они необходимы лишь в той мере, чтобы придать напитку тон брожения.
Сложные эфиры. Из них этилацетат как отрицательный фактор при повышенных концентрациях, определяющий порок вина — «штих», и допустимый лишь в той мере, чтобы придать вину наравне с высшими спиртами тон брожения. Энантовые эфиры, являющиеся смесью этиловых эфиров высших жирных кислот, несомненно ценны для обогащения букета и вкуса вин и при том совершенно безвредные для организма.
Азотистые вещества для большинства типов вин являются положительным фактором, поскольку во время выдержки, при дезаминировании аминокислот, способствуют образованию карбонильных соединений, обогащающих букет вин, особенно крепленых. Для белых столовых и шампанских виноматериалов азотистые вещества желательны лишь в оптимальных количествах, так как при превышении их развиваются тона переокисленности и грубости.
Остальные компоненты примесей также влияют на качество вин. В данной статье мы, однако, сочли необходимым изучить в условиях поточного брожения в первую очередь поведение высших спиртов, сложных эфиров и азотистых веществ.
МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЙ
Периодическое брожение виноградного сусла проводили в бутылках в аэробных условиях, которые обеспечивались свободным притоком воздуха через ватную пробку.

Схема лабораторного аппарата непрерывного сбраживания виноградного сусла.
Поточное брожение осуществляли на лабораторном аппарате, состоящем из горизонтальных стеклянных сосудов — секций, соединенных последовательно переходными трубками. Сосуды емкостью 350—400 л/д, расположенные наклонно в деревянном штативе, помещали в два водяных термостата, в которых автоматически поддерживалась необходимая температура. Таким образом, аппарат представлял собой ряд сообщающихся сосудов-секций, где сусло перетекало из верхней части каждой предыдущей в нижнюю часть последующей секции и так далее (см. рисунок).
Притек свежего виноградного сусла в аппараты осуществлялся автоматически действующим дозатором, работа которого основана на принципе свободного вытекания определенного объема жидкости в единицу времени.
Сбродившее виноградное сусло отводилось в специальные приемники с двойными бумажными фильтрами для отделения виноматериала от дрожжей. В результате получали отфильтрованный виноматериал, зафиксированный на определенном этапе брожения, с 8—9% остаточного сахара — середина брожения (2-секционный аппарат) и с 0,5— 1 % остаточного сахара — конец брожения (4-секционный аппарат).
Аппараты поточного брожения работали при температуре 20 и 28 оС.
Брожение вели на дрожжах расы Феодосия 1 —19 вида Sacclialomyces vini. Двухсуточную дрожжевую разводку вводили в каждую секцию бродильного аппарата в количестве 6% от объема секции.
Секции бродильного аппарата заполняли последовательно, начиная с последней, ежесуточно при температуре брожения 28 °C и через двое суток — при 20 °C. Непрерывный поток в подаче сусла на брожение устанавливался после полного выбраживания сахара в последней секции четырехсекционного аппарата и после сбраживания до 8—9% остаточного сахара во второй секции двухсекционного аппарата.
Опыты по поточному брожению вели на пастеризованном сусле, содержащем 21% сахаров, и на свежем виноградном сусле из сорта Кульджинский, содержащем после отстаивания 17,2% сахаров, 82 мг л SO2 общей, 33 мг/л SO2 свободной, 10,4 г/л титруемых кислот. Во время отстаивания свежее сусло обрабатывалось пектолитическим ферментным препаратом «Нигрин ПК» в количестве 0,05 г/л.
Режим брожения устанавливали по количеству сахаров, содержание которых в виноматериале находили по удельному весу. В виноматериалах определяли общее количество высших спиртов колориметрическим методом — по реакции окрашивания с n-диметиламинобензальлегидом [6]; содержание сложных эфиров (этилацетата и энантовых эфиров) - по методу А. А. Налимовой [7]; общее количество азота методом Квельдаля.
Образование высших спиртов и сложных эфиров винными дрожжами в процессе непрерывного брожения
Высшие спирты влияют на вкус и букет вин и в зависимости от строения различаются по запаху [12].
Амиловый, гексиловый и гептиловый спирты имеют фруктовый запах; нониловый и дециловый при разбавлении приобретают цветочный запах с тонами розы; бутиловый и изоамиловый спирты при любом разбавлении обладают запахом с сивушным оттенком. Изоамиловый, изобутиловый и н-пропиловый спирты представляют основную массу сивушных масел, состав которых меняется как количественно, так и качественно в зависимости от природы сбраживаемой среды, используемых дрожжей, условий брожения и многих других факторов.
Таким образом, сивушные масла, находящиеся в сброженном материале в большом количестве, могут придать вину неприятный сивушный тон и в известной мере оказывать также нежелательные воздействия на организм человека, ибо обладают выраженным наркотическим действием [19].
В литературе имеются сведения о содержании высших спиртов, синтезируемых винными дрожжами при периодическом брожении виноградного сусла. Однако данные о влиянии различных условий брожения на процесс образования высших спиртов весьма противоречивы. По данным Е. Пейно и Г. Гумберто [16], большее количество высших спиртов образуется в более анаэробных условиях. По сведениям А. Г. Канн и Π. М. Грачевой [4] и Μ. Т. Денщикова с С. С. Рылкиным и других [1], увеличение аэрации снижает образование высших спиртов. По данным же Ж. Ингрехема и Ж. Гюймо [14], аэрация усиливает биосинтез высших спиртов.
Оптимальной температурой для образования высших спиртов Пенно и Гумберто [16] считают 20 °C. При температуре 35 °C количество их составляет не более четвертой части, накопившихся при 20 °C.
Μ. Т. Денщиков и другие [1] приводят данные по количеству высших спиртов в пиве, полученном при поточном брожении. Они сообщают, что с продолжительностью опыта количество высших спиртов достигает своего максимального значения: на выходе из поточного аппарата в первые дни работы пиво содержало 120 мг/л высших спиртов, к концу 34 суток брожения — 230 мг/л.
Столь противоречивые данные о биосинтезе высших спиртов должны быть рассмотрены на современном уровне знаний, на основе известных нам теорий.
Еще Ф. Эрлихом было высказано и экспериментально показано, что дрожжи, используя аминные группы аминокислот в качестве азотного питания, освобождают неиспользованный углеродный скелет аминокислоты в виде соответствующего спирта, содержащего на один углеродный атом меньше, чем исходная аминокислота. Таким образом, карбоксильная группа аминокислоты отщепляется в виде СО2, а аминная— в виде ΝΗ3. Правильность этого положения была подтверждена многочисленными опытами различных исследователей как на синтетических средах, так и на нативных субстратах, в том числе с добавкой какой-либо определенной аминокислоты, которая при выбраживании давала соответствующий спирт.
Так как необходимость азотного питания дрожжей наиболее резко проявляется при их размножении, то естественно предположить, что наивысшее напряжение биосинтеза высших спиртов следует ожидать в фазе разбраживания и накопления биомассы. Точно так все факторы, способствующие размножению дрожжей, а следовательно их усиленному азотному питанию (например, аэрация), должны приводить к повышению биосинтеза высших спиртов. Со временем, при накоплении опытных данных, появилось предположение, что биосинтез высших спиртов по механизму Эрлиха не является единственным.
В ряде работ [13, 15] было показано, что высшие спирты в бродящих средах под действием ферментных систем дрожжей могут быть синтезированы из сахаров через уксусный альдегид.
По мнению некоторых исследователей [20], большая часть высших спиртов синтезируется из уксусного альдегида и лишь меньшая — по механизму Эрлиха Остается неясным, какие же условия брожения и состояния дрожжей благоприятствуют синтезу высших спиртов на базе уксусного альдегида.
Нельзя не обратить внимание также и на то обстоятельство, что дрожжи, используя одну или ограниченное количество аминокислот, способны осуществлять биосинтез самых разнообразных аминокислот. Это явление, описанное Е. Пейно и С. Лафон-Лафуркад [18], впоследствии было подтверждено А. К. Родопуло, И. А. Егоровым и Н. Г. Саришвили [10]. В работе Η. М. Сисакяна, А. К. Родопуло и других [11], например, показано, что если дрожжи имеют в качестве азотного питания фенилаланин, то после некоторого времени инкубации они образуют в среде ряд аминокислот: лизин, аспарагиновую кислоту, серин, глицин, метионин, валин, лейцин, а по окончании брожения — из высших спиртов не только фенилэтиловый, по и метиловый, изобутиловый и изоамиловый спирты. Можно предположить, что вначале происходило трансаминирование с образованием разнообразных аминокислот, которые потом использовались, вероятно, по механизму Эрлиха с образованием соответствующих высших спиртов. На возможность такого процесса указывают Е. Пейно и Г. Гумберто [16, 17]. Биохимия этих процессов еще подлежит более глубокому изучению.
Сведений о биосинтезе высших спиртов винными дрожжами в процессе поточного брожения виноградного сусла почти нет, в то время как поточное брожение находит широкое применение и принимает производственные масштабы в винодельческой промышленности.
ИЗМЕНЕНИЯ КОЛИЧЕСТВА ОБЩЕГО АЗОТА В ВИНОМАТЕРИАЛАХ ПРИ ПОТОЧНОМ БРОЖЕНИИ
Изменения количества общего азота при поточном брожении должны быть рассмотрены в первую очередь, поскольку они убедительно раскрывают динамику нарастания биомассы, а это коррелирует с изменениями таких важных для нас продуктов обмена дрожжей, как высшие спирты.
В табл. 1 представлены данные двух опытов, из которых один продолжался при температуре 20 °C 21 сутки, а при 28 °C — 24 суток; второй при 20 °C — 42 суток, а при 28 °C — 27 суток.
Таблица 1
Изменение общего количества азота (в мг/л) в процессе непрерывного брожения виноградного сусла

Из данных таблицы 1 вытекает, что по мере удлинения срока работы поточного бродильного аппарата количество остаточного азота в виноматериале возрастает независимо от того, исследуется ли недоброд при содержании 8—9% сахаров или насухо выброшенный материал. Характер изменений азота при температурах брожения 20 и 28 °C одинаков. Ход изменений не всегда происходит со строгой равномерностью потому, что на потребление азота дрожжами влияло содержание кислорода в сусле, подаваемом на брожение, неучитываемое в нашем опыте.
По тому, что с каждым днем работы аппарата азота потреблялось все меньше и меньше, можно судить о постепенном снижении размножения дрожжей, а возможно и о полном прекращении размножения.
В основе остаточного азота виноматериалов могут быть азотистые вещества сусла, недоиспользованные дрожжами, продукты, выделяемые живыми дрожжами, но могут быть и продукты частичного автолиза отмерших дрожжей. Главным фактором здесь является температура брожения, так как при возрастающей спиртуозности и повышенной температуре отмирание дрожжей и автолиз их происходят в больших масштабах.
Следует также отметить, что в ходе поточного брожения винодел, очевидно, имеет возможность отбирать виноматериалы одного типа, но с самым разнообразным содержанием азотистых веществ. В этом и заключаются огромные возможности влияния на качество вин.
В этой статье приводим сведения лишь ио общему содержанию азотистых веществ при поточном брожении, однако состав их представляет особый интерес и в этом направлении работы будут продолжены.
ИЗМЕНЕНИЕ СОДЕРЖАНИЯ ВЫСШИХ СПИРТОВ В ВИНОМАТЕРИАЛАХ ПРИ ПОТОЧНОМ БРОЖЕНИИ
Выше было показано, что содержание азотистых веществ в виноматериалах при поточном брожении закономерно изменяется. Это позволило предположить, что во всяком случае в тон части биосинтеза высших спиртов, который протекает по механизму Эрлиха, биосинтез должен быть связан с изменениями азотистых веществ, поскольку они используются при размножении дрожжей.
Данные таблицы 2 полностью подтверждают это предположение.
Из данных табл. 2 видно, что с продолжительностью работы поточного бродильного аппарата количество высших спиртов в принимаемых виноматериалах постепенно падает. Так, в опыте 1 при 28°C на 3-и сутки работы бродильного аппарата на свежем сусле содержание высших спиртов в виноматериалах было 179 мг/л, а на 24-е сутки всего лишь 82 мг/л. Эта закономерность не всегда четко выражена, по нашему мнению, вследствие того, что иногда содержание кислорода в подаваемом на брожение сусле могло быть и более высоким, усиливающим размножение дрожжей, потребление азота и биосинтез высших спиртов.
Обращает на себя внимание также и то, что при периодическом брожении количество высших спиртов в виноматериалах всегда выше среднего количества, накапливающегося при поточном брожении, а соответственно и потребление азота тоже выше.
Теоретические соображения приводят к тому, что при периодическом брожении должно быть больше высших спиртов, так как потребление азота и размножение дрожжей относительно объема среды в этом случае больше.
При поточном брожении биомасса может использоваться более длительное время при сокращенном размножении. Это видно по потреблению азота, которое сильно сокращается при длительной работе бродильного аппарата (см. табл. 1).
В таблицы 3 приведены данные о содержании высших спиртов в каждой секции поточного бродильного аппарата по окончании опыта, когда поток был остановлен.
Таблица 2
Биосинтез высших спиртов (в мг/л) винными дрожжами в процессе поточного брожения (лабораторный аппарат)

Примечание. В рамке показано среднее количество высших спиртов по опыту в конце брожения.
Таблица 3
Содержание высших спиртов в виноматериале по секциям в конце опытов (лабораторный четырехсекционный аппарат)

При поточном брожении количество высших спиртов в последовательно расположенных секциях должно нарастать. Если принять объем каждой секции равным 1 л, то масштабы биосинтеза высших спиртов в каждой секции могут быть представлены в виде табл. 4, данные которой получены вычитанием количества высших спиртов в каждой последующей секции из количества их в предыдущей (см. табл. 3).
Из данных таблицы 4 следует, что биосинтез высших спиртов зависит от температурь: брожения и имеет тенденцию снижаться при повышении температуры и спиртуозности. Поэтому количество высших спиртов в виноматериале, выброженном при 20° С, несколько выше, чем при 28° С, что согласуется с данными Е. Пенно [16]. Механизм этого явления несомненно заключается в том, что при повышении температуры в указанном диапазоне и при одновременном повышении спиртуозности снижается потребление дрожжами азота. Это означает сокращение размножения дрожжей и, как следствие, снижение биосинтеза высших спиртов. Возможно, что одновременно подавляется и ферментный синтез высших спиртов из ацетальдегида, однако это требует еще дополнительного исследования.
Таблица 4
Уровень накопления высших спиртов в каждой секции аппарата в зависимости от температуры брожения

ИЗМЕНЕНИЕ СОДЕРЖАНИЯ ЭТИЛАЦЕТАТА И ЭНАНТОВЫХ ЭФИРОВ В ВИНОМАТЕРИАЛАХ ПРИ ПОТОЧНОМ БРОЖЕНИИ
Если биосинтез спиртов и кислот в бродящих жидкостях зависит от жизнедеятельности дрожжей, то образование сложных эфиров может протекать и без их участия при условии наличия в среде спиртов и кислот. Вот почему процессы этерификации продолжаются и после того, как виноматериал отделен от дрожжей. Однако в присутствии дрожжей эти процессы протекают быстрее, что обусловлено наличием эстераз. Вероятно эта ферментная функция в эволюции организмов развилась в связи с тем, что в ходе этерификации гасились токсичные для клетки гидроксильные группы спиртов и кислот, в результате чего накапливались сложные эфиры и глицериды в больших количествах в качестве запасных материалов.
В виноделии сложные эфиры в зависимости от состава и концентрации играют положительную или отрицательную роль. Поэтому знание закономерностей образования и накопления их имеет практическую ценность.
Многочисленными опытами по выбраживанию при 20°С было установлено, что в процессе поточного брожения содержание этилацетата очень низкое и колеблется от 0 до 17 мг/л, а при 28°С — еще ниже. При периодическом брожении содержание этилацетата колебалось в пределах 35—80 мг/л, т. е. было значительно выше. Обусловлено это тем, что при поточном брожении виноматериал отделялся от дрожжей через строго определенные и короткие промежутки времени, зависящие от скорости потока, а именно: в случае насухо выбраживаемых материалов через 2—4 суток. При периодическом же брожении виноматериал оставался на дрожжах до осветления в течение 7—10 суток.
Таким образом, при периодическом брожении время контакта с дрожжами, а следовательно и время течения ферментных реакций этерификации, было более длительным, что и явилось причиной более высокого содержания этилацетата.
Так как этилацетат кипит при 77°С, то во время брожения некоторое количество его уносится вместе с током углекислоты и тем больше, чем выше температура. Этим и объясняется снижение этилацетата в виноматериалах, бродивших при 28°С по сравнению с бродившими при 20о С.
Что касается энантовых эфиров, то количество их колебалось в пределах 6—13 мг/л при поточном брожении и в пределах 6—15 мг/л при периодическом. Биосинтез энантовых эфиров будет рассмотрен в отдельном сообщении.
ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
Мы рассмотрели изменения содержания азотистых веществ в бродящей среде и биосинтез высших спиртов при поточном брожении виноградного сусла. Полученные экспериментальные данные показывают, что биосинтез высших спиртов связан с изменениями количества азотистых веществ бродящей среды, а именно, при снижении потребления азотистых веществ дрожжами биосинтез высших спиртов падает, а при повышении — возрастает.
Так как потребление азотистых веществ связано с актом размножения дрожже/i, то мы приходим к выводу, что колебания в количестве высших спиртов могут быть объяснены биосинтезом их по механизму Эрлиха, вероятно, осложненному явлениями трансаминирования. Этим мы не отрицаем других путей биосинтеза высших спиртов, в том числе и из сахаров через уксусный альдегид. Однако эти процессы при прочих равных условиях протекают равномерно и, по-видимому, не изменяются при поточном брожении по сравнению с периодическим.
Таким образом, колебания в биосинтезе высших спиртов связываются с потреблением азотистых веществ дрожжами и размножением дрожжей, ио так как размножение дрожжей зависит прежде всего от кислородного питания, температуры брожения и спиртуозности среды, то естественно, что эти факторы будут определять напряжение биосинтеза высших спиртов.
В этом смысле поточное брожение по сравнению с периодическим может иметь лишь то преимущество, что дрожжи могут работать более длительное время (одна и та же масса дрожжей при поточном брожении может выбродить больший объем сусла) и поэтому концентрация высших спиртов будет снижена.
Однако это будет наблюдаться лишь в том случае, если поточное брожение ведется с определенной направленностью.
Если же при поточном брожении стимулировать размножение дрожжей небольшим подсосом воздуха или использовать низкосахаристое сусло (например, в производстве пива) так, что на выходе виноматериала спиртуозность невысокая, не подавляющая размножение дрожжей, то в этом случае биосинтез высших спиртов при поточном брожении будет равен или даже выше, чем при периодическом.
Вероятно этими обстоятельствами объясняются противоречия в опенке результатов поточного брожения в отношении биосинтеза высших спиртов.
ВЫВОДЫ
В. И. НИЛОВ, Н. И. БУРЬЯН, Л. В. ТЮРИНА, Г. Д. ВОДОРЕЗ