Методы биохимических исследований

К биохимическим методам анализа относятся: центрифугирование, спектрофотометрия, хроматография, флюориметрия, электрофорез, хемилюминесценция. Спектрофотометрия используется чаще, чем другие методы.

Метод спектрофотометрии основан на следствии закона Бугера-Ламберта-Бера, согласно которому концентрация вещества в растворе пропорциональна оптической плотности раствора.

Каждое вещество имеет максимальный пик поглощения энергии света при определенной длине волны.

Схема спектрофотометра

Источник света (лампа накаливания для измерения в диапазоне видимого света 400-760 нм или водородная лампа для измерения в ультрафиолетовом диапазоне 200-400 нм).
Линза и зеркала для фокусировки света.
Монохроматор – трехгранная призма, которая расщепляет пучок света на все цвета радуги.
Дифракционная решетка с отверстиями. Призма может поворачиваться, чтобы через отверстие решетки проходил узкий луч света 2-3 нм.
Кювета с исследуемым раствором, который поглощает часть энергии света.
Фотоэлемент, преобразующий энергию света в электрическую энергию.
Детектор, измеряющий напряжение.
Компьютер с установленной программой для работы спектрофотометра. На дисплее компьютера отражается величина оптической плотности раствора.
Поставить в штатив пробирки: одну для раствора сравнения (или blanc), две – для стандартного раствора и остальные для опытных проб, по одной для каждой плазмы крови (использовали 2 образца плазмы), подписать пробирки.
В каждую пробирку отмерить дозатором 3,0 мл готового реактива из набора, содержащего глюкозооксидазу и другие вещества.
В 2 пробирки добавить по 30 мкл стандартного раствора глюкозы (концентрация 5,5 ммоль/л), в одну -30 мкл дистиллированной воды, в остальные – по 30 мкл плазмы крови.
Поставить штатив с пробирками в термостат (37°С) на 20 минут для развития окраски.
Открыть программу спектрофотометра на компьютере и установить длину волны 510 нм (максимально поглощение энергию света глюкозой).
Перелить растворы из пробирок в кюветы и установить кюветы в каретку спектрофотометра. В первую ячейку каретки ставят blanc, по которому прибор настраивается, оптическая плотность blanc автоматически вычитается из остальных измерений.
Измерить оптическую плотность растворов.
Подсчитать концентрацию глюкозы в образцах плазмы крови по формуле:

Для биохимического анализа чаще используют плазму или сыворотку крови.

Для получения плазмы в сухую пробирку добавляют антикоагулянт (гепарин, ЭДТА, соль лимонной кислоты), чтобы не образовался сгусток крови.

Плазму от форменных элементов (эритроцитов, лейкоцитов и тромбоцитов) или сыворотку от сгустка крови отделяют центрифугированием.

Устанавливают режим центрифугирования: температура 4°С, время центрифугирования 10 минут и скорость 3000 оборотов в минуту или1006 g, то есть ускорение в центрифуге при данной скорости превышает ускорение свободного падения 9,8 м/сек² в 1006 раз. Пробирки должны быть уравновешены, крышка центрифуги закрыта.

Спектрофотометрический метод определения глюкозы в сыворотке или в плазме крови

Для определения используют отечественный набор готовых реактивов фирмы «Вектор БЕСТ» и спектрофотометр СФ-56.

Принцип метода:

Фермент глюкозооксидаза катализирует окисление глюкозы кислородом воздуха, образуются глюконовая кислота и пероксид водорода. Пероксид водорода при взаимодействии с 4-аминоантипирином и фенолом под действием фермента пероксидазы образует окрашенный продукт хинонимин. Интенсивность окраски хинонимина пропорциональна концентрации глюкозы.

Ход работы

Отмерить дозатором	Раствор сравнения (blanc)	Стандарт	Опытная проба
Реактив	3,0 мл	3,0 мл	3,0 мл
Дистиллированная вода	30 мкл	-	-
Стандартный раствор глюкозы	-	30 мкл	-
Плазма крови	-	-	30 мкл

С оп. = Dоп ∙ Cст / Dст, где

Соп – концентрация опытного раствора;

Dоп – оптическая плотность опытного раствора;

Cст – концентрация стандартного раствора;

Dст – средняя оптическая плотность стандартного раствора.

Полученные результаты:

Dст1 = 0,128 Dст2 = 0.117 Среднее значение Dст=0,1225

Сст = 5,55 ммоль/л

Dоп1 = 0,070

Dоп2 =0, 355

Концентрация глюкозы в образце плазмы 1 = 3,2 ммоль/л

Концентрация глюкозы в образце плазмы 2 = 16,1 ммоль/л

Норма содержания глюкозы в крови человека 3,3-3,5 ммоль/л

Клинико-диагностическое значение определения глюкозы в крови

Повышение содержания глюкозы в крови наблюдается после приема пищи, поэтому пациенты должны сдавать кровь натощак. В крови, взятой натощак, уровень глюкозы может быть выше нормы при сахарном диабете, повышенной функции щитовидной железы, надпочечников, гипофиза. При сахарном диабете 1 типа уровень глюкозы может резко возрастать. Если в крови глюкоза выше 10 ммоль/л, то в моче будет положительная проба на глюкозу. При сахарном диабете 2 типа содержание глюкозы в крови часто на верхней границе нормы, в этом случае назначают провести тест толерантности к глюкозе (ТТГ). При поражении печени также может быть гипергликемия, так как в этом органе избыточная глюкоза должна превращаться в гликоген и в жиры.

Снижение содержания глюкозы в крови наблюдается при длительном голодании, недоедании, у кормящих грудью женщин, при передозировке инсулина и недостаточной функции щитовидной железы, надпочечников, гипофиза.

Примечание:

Оптическая плотность не имеет единиц измерения, изменяется от 0 до бесконечности, но практически используют диапазон от 0 до 2. Если результат больше 2, то исследуемый раствор следует разбавить и учесть величину разведения.
Раствором сравнения обычно считается растворитель без плазмы крови, но иногда прибор настраивают по дистиллированной воде или по воздуху.
Если окраска стандартного раствора устойчива, не отличается в разные дни и не изменяется с течением времени, можно подготовить калибровку, определяя оптическую плотность нескольких стандартных растворов разной концентрации. Калибровочный коэффициент подсчитывают как среднее значение нескольких измерений стандарта, например: К =(Сст1/Dст1 + Сст2/Dст2 + Сст3/Dст3 + Сст4/Dст4 + Сст5/Dст5) : 5
Кюветы надо держать за непрозрачные грани, а прозрачные, через которые проходит луч света, протирать фильтром, чтобы не было дополнительного поглощения от отпечатков пальцев и капель раствора.
Количество жидкости в кювете должно быть достаточным, чтобы луч света не проходил через мениск (изогнутую поверхность вверху). Для кюветы толщиной 1 см достаточно 3,0 мл.
При измерении в ультрафиолетовом диапазоне кюветы должны быть из кварцевого стекла.
Вымытые влажные кюветы не должны соприкасаться гранями, так как после высыхания грани слипаются, и кюветы ломаются.

Основные разделы